在免疫效應功能研究和藥物誘導細胞毒性評價等廣泛的體外應用中，細胞死亡定量檢測是核心環節。乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）釋放試驗操作簡便、可規模化，被廣泛用于評估細胞膜完整性損傷。本文綜述了LDH檢測法的基本原理與固有局限性，并重點闡述如何通過優化顯色讀數系統來提升檢測的可靠性。

1 LDH釋放：細胞毒性標志物

1.1 細胞毒性檢測方法概述

細胞毒性（Cytotoxicity）涵蓋了細胞對損傷性刺激產生的一系列反應譜，從細胞功能的短暫改變到不可逆的膜損傷及細胞死亡。歷史-上，研究者開發了多種方法來定量檢測體外細胞死亡：

• 鉻⁵¹（Chromium，Cr⁵¹）釋放試驗：雖然具有高靈敏度，但涉及電離輻射危害和法規限制¹

• 熒光標記法（如膜不通透性DNA染料（如碘化丙啶，Propidium Iodide）、胺反應性活性染料）：可實現敏感的單細胞分析，但需要專門的儀器和多步驟流程，限制了其可擴展性²

這些限制促使比色法LDH釋放試驗成為常規細胞毒性評估的實用替代方案^1,2。

1.2 膜損傷后的LDH釋放

LDH是一種穩定的胞質酶，參與乳酸代謝循環。細胞膜破裂后，LDH迅速釋放至細胞外環境，其活性可用于評估多種細胞死亡方式，包括壞死（Necrosis）、壞死性凋亡（Necroptosis）和焦亡（Pyroptosis）。在細胞凋亡（Apoptosis）、鐵死亡（Ferroptosis）或氧化性細胞死亡（Oxidative Cell Death）的晚期階段，一旦質膜被破壞，也可檢測到LDH釋放。因此，LDH活性檢測主要反映的是細胞膜完整性的喪失，而非細胞死亡的具體機制。

1.3 比色法LDH檢測原理

LDH活性通過酶促反應進行測定：LDH將乳酸氧化為丙酮酸，同時將NAD+還原為NADH。隨后，NADH在催化劑（如黃遞酶（Diaphorase）或吩嗪類電子介體）的作用下驅動四唑鹽還原，生成有色（傳統為紅色）的甲臜（Formazan）產物，可通過分光光度法定量1-4。甲臜信號與細胞外LDH活性成正比，可提供定量且線性的細胞膜破壞程度指標。

圖1：比色法LDH釋放測定原理。

圖示為受損細胞釋放LDH的過程，以及使用基于甲臢的比色法進行定量分析。底部圖示為孔內培養基顏色的變化，使用LDH-Blue™ Plus（InvivoGen）時，培養基顏色由淺橙色變為藍紫色；而使用傳統檢測方法（競品）時，培養基顏色則變為橙紅色，二者顏色變化與LDH活性成正比。

1.4 傳統LDH檢測法的局限性

盡管基于紅色甲臜的傳統LDH檢測法應用廣泛，但仍存在一些可能影響數據解讀的局限性3：

? 與培養基中的酚紅（Phenol Red）光譜重疊，導致背景信號升高

? 自發釋放LDH產生的高基線信號，可能掩蓋低水平細胞毒性

? 由于背景信號和基線信號均較高，動態范圍受限

? 在高密度培養條件下，檢測線性下降

這些問題共同凸顯了改進LDH檢測設計以增強信號分辨能力的必要性。

2 LDH-Blue^™ Plus：克服關鍵限制

2.1 改進比色讀數

克服上述局限的一種有效途徑在于重新設計顯色輸出系統。將反應產物從紅色甲臜轉變為藍色甲臜，通過這一光譜轉移，可以使信號生成與培養基中酚紅產生的背景吸光度解耦。研究人員通過細胞裂解試驗，直觀比較藍色（LDH-Blue^™ Plus, InvivoGen）與紅色（競品）甲臜的顯色效果，評估光譜偏移對肉眼觀察的影響。

圖2：使用藍色甲臜肉眼清晰檢測LDH活性。

將THP1-Null2細胞以遞減的密度接種于含酚紅的RPMI培養基（含裂解緩沖液）中培養30分鐘。使用LDH-Blue^™ Plus（InvivoGen）或兩款競品的LDH檢測試劑盒定量檢測上清液中的LDH活性。反應在LDH檢測試劑加入孔板后立即開始，并隨時間推移而進行。

傳統紅色甲臜信號在視覺上容易與培養基顏色混雜。與紅色甲臜不同，藍色甲臜信號便于肉眼監測反應進程和最佳終止時間。這種明顯的藍紫色變化提高了實驗的易用性，并降低了信號飽和的風險。

2.2 擴大檢測范圍

我們評估了光譜偏移對LDH釋放檢測范圍（即最大與最小吸光度信號之差）的影響。最大吸光度信號通過完-全細胞裂解獲得；最小吸光度信號包括背景吸光度（來自酚紅和添加到培養基中的血清中的LDH的信號）和基線吸光度（測試細胞自發釋放的LDH）。

結果顯示，在含酚紅的RPMI培養基中，傳統的LDH檢測范圍受限，因為它們會檢測到來自酚紅的背景信號。相比之下，LDH-Blue^™ Plus避免了來自酚紅的背景信號干擾，從而能夠更清晰地區分低水平和高水平的細胞毒性。

圖3：使用紅色或藍色甲臜讀數的細胞毒性檢測范圍。

將THP1-Null2細胞（2x10^?）在含酚紅的RPMI培養基（添加/不添加裂解緩沖液）中培養30分鐘。使用LDH-Blue^™ Plus（InvivoGen，650nm波長吸光度）或兩款競品的LDH檢測試劑盒（490nm波長吸光度）定量LDH活性。檢測范圍以未處理細胞與完-全裂解細胞的LDH活性信號比值計算。數據以平均值±SEM表示。

這些數據表明，使用藍色甲臜可提高檢測靈敏度，這對早期藥物篩選或低細胞毒性監測等應用至關重要。此外，無需為檢測調整細胞培養條件。

2.3 確保線性關系

準確的細胞毒性定量依賴于甲臜生成量與細胞膜破壞程度成正比這一前提。為了評估這種關系，我們分析了多種細胞類型（包括貼壁和懸浮細胞）中LDH信號與細胞密度的相關性。

圖4：裂解細胞數量與釋放的LDH活性之間的關系。

將不同數量的(A)THP-1人單核細胞、(B)RAW264.7小鼠巨噬細胞、(C)A549人肺癌細胞或(D)人外周血單核細胞（PBMCs）在裂解緩沖液中培養30分鐘。使用InvivoGen的LDH-Blue^™ Plus（650nm波長吸光度）或兩種競品LDH檢測試劑盒（490nm波長吸光度）定量上清液中的LDH活性。數據以平均值±SEM表示。每種LDH檢測試劑盒的線性回歸R²值見圖。

傳統的LDH檢測在較高信號強度時，表現出偏離線性的趨勢，可能源于背景和基線吸光度的增加所致。相比之下，LDH-Blue™ Plus在細胞密度和LDH活性之間保持了良好的線性相關性（R²>0.97）。

通過最小化背景干擾并保持信號比例性，藍色甲臜讀數能夠在各種實驗條件下實現一致且可靠的定量分析。這減少了在檢測前對細胞密度進行嚴格優化的必要性。

2.4 提高檢測精度

焦亡是炎癥小體激活的主要結果，通常通過定量檢測LDH釋放來評估。我們在NLRP3炎癥小體激活模型中比較了LDH-Blue^™ Plus與競品的檢測效果。

使用THP-1人單核細胞（炎癥小體研究的經典細胞模型）在96孔板以2×10?細胞/孔的密度接種。用NLRP3激活劑尼日利亞菌素（nigericin）處理細胞。當使用藍色或傳統紅色甲臜檢測方法進行檢測時，兩種檢測方法均顯示在上清液中LDH呈劑量依賴性釋放。

然而，傳統紅色檢測方法報告的LDH活性系統性地高于LDH-Blue^™ Plus。更重要的是，在這種細胞密度下，傳統紅色檢測方法的信號不再呈線性關系。

圖5：使用紅色或藍色甲臜讀數對細胞焦亡進行定量檢測。

將THP1-Null2（2x10^?）用1μg/ml LPS-EK預處理3小時，然后用遞增濃度的尼日利亞菌素孵育以誘導細胞焦亡。6小時后，使用InvivoGen的LDH-Blue^™ Plus或兩種競品LDH檢測試劑盒定量檢測釋放的LDH活性。結果以細胞裂解后的最大LDH釋放量進行標準化（平均值±SEM）。

傳統紅色檢測方法在超出線性范圍時，焦亡測量的準確性受到影響，導致細胞死亡的高估。這種偏差會干擾數據的正確解讀，尤其是在評估藥物化合物毒性時。

因此，我們檢測了基于藍色和傳統紅色甲臜的LDH釋放檢測方法的準確性，并將其與使用胺反應染料測量細胞膜完整性的流式細胞術參考方法（Live/Dead^®檢測）進行了比較。

圖6：細胞死亡定量準確性的比較。

將THP1-Null2（2x10^?）與0.3μM星形孢菌素共同培養24小時以誘導晚期凋亡。與裂解緩沖液共同培養30分鐘作為陽性對照。使用Live/Dead^® assay流式細胞術試劑盒（Invitrogen, #L34966、InvivoGen的LDH-Blue^™ Plus或兩種競品LDH檢測試劑盒測定釋放的LDH活性來定量細胞死亡。結果以相對于Live/Dead^®檢測結果的細胞死亡百分比表示（平均值±SEM）。相對于Live/Dead^®檢測結果，細胞死亡高估的程度以紅色標出。

在細胞毒性后期（星形孢菌素誘導的細胞凋亡）中，傳統LDH釋放檢測方法報告的表觀細胞毒性高于流式（分別為+21%和+41%），而LDH-Blue^™ Plus檢測方法與流式的結果非常接近（+1%）。

總體而言，這些研究結果表明，傳統LDH檢測中升高的背景和基線吸光度會引入系統誤差，從而夸大表觀細胞毒性，尤其是在膜損傷有限或發生在早期階段的情況下。LDH-Blue™ Plus可最大限度地減少高估，并提供與參考檢測方法一致的細胞毒性測量結果。

2.5 支持可重復性

試劑穩定性是決定實驗可重復性的關鍵因素。

☆ LDH-Blue^™ Plus在4°C儲存一個月后，仍能保持穩定的信號強度和動態范圍，同時維持線性關系。

☆ 相比之下，傳統LDH檢測方法在儲存后會出現信號強度降低、動態范圍縮小，表明試劑性能下降。

圖7：試劑在4°C儲存后的性能穩定性。

使用遞增數量的裂解THP1-Null2細胞生成LDH釋放信號，分別使用(A)InvivoGen的LDH-Blue^™ Plus（650nm吸光度）或(B,C)兩種競品LDH檢測試劑盒（490nm吸光度）進行測量。檢測使用現配的試劑混合物或在4°C下儲存1個月的試劑混合物進行（平均值±SEM）。

LDH-Blue^™ Plus在4°C儲存期間確保信號穩定，避免實驗間差異，支持常規工作流程中的可靠定量。

3 結論

LDH 釋放試驗是細胞毒性定量的常用工具，但依賴紅色甲臜的傳統檢測方法存在一些局限性，會影響測量的可靠性，需要大量的優化。

LDH-Blue^™ Plus基于藍色甲臜的比色讀數系統，從紅色到藍色的轉變改善了信號分辨能力，減少培養基中酚紅的背景干擾，從而實現了：

? 靈敏度：更大的檢測范圍

? 準確度：更高的信號線性度

?一致性：更穩定的線性度，便于跨實驗和跨實驗室數據的精確比較

此外，LDH-Blue^™ Plus還為常規工作流程提供多項實用優勢：

? 清晰的肉眼觀察反應監測和最佳終止時間

? 與標準含酚紅培養基的兼容性以及在各種細胞密度下均能進行穩健的定量分析，從而減少了優化需求

? 此外，該試劑盒經過特殊設計，可在4°C儲存時提高試劑穩定性。

綜上所述，這些特性使LDH-Blue^™ Plus成為研究和篩選應用中準確評估細胞毒性的可靠且易于使用的解決方案。

*本文為 InvivoGen 原創，版權歸 InvivoGen 所有。

參考文獻

1. Korzeniewski, C. & Callewaert, D. M., 1983. J Immunol Methods.

2. Cummings, B. S. & Schnellmann, R. G., 2004. Curr Protoc Pharmacol. 12(12.8). 

3. Kaja, S. et al., 2017. Curr Protoc Toxicol.

4. Decker, T. & Lohmann-Matthes, M. L., 1988. J Immunol Methods. 

研究工具

InvivoGen的LDH-Blue™ Plus是一款全新且更穩定的創新型比色法檢測試劑盒，用于測定受損或裂解細胞培養上清液中的LDH活性。該試劑盒采用可生成藍色甲臜產物的底物，使培養基顏色由淡紅色變為藍紫色。

如需了解更多，請聯系我們InvivoGen授權代理商—欣博盛生物